電子偏光顯微鏡的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
發(fā)布人：shpuda發(fā)布時間：2014/1/23
電子偏光顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)又稱免度電鏡技術(shù)，它是把電子顯微技術(shù)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，使抗原或抗體在亞細(xì)胞水平上得到定位的技術(shù)。由于抗原或抗體的結(jié)合產(chǎn)物在電鏡下看不到，必須借用細(xì)胞化學(xué)方法，把抗體用腳、鐵蛋白、膠體金、同位素等進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記物的不同，可分為免疫降細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)等。
免疫膠體金技術(shù)
1971年Faulk首次把膠體金作為特異性標(biāo)記物用于免痊電鏡技術(shù)，20多年以來，巳廣泛應(yīng)用于透射電鏡下各種生物大分子的定位、定性、半定量等的研究，同時還應(yīng)用于掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡的研究。
原理:抓化金用還原劑處理，使其一合成特定大小的頤校，城位間由于靜電排斥作用使其保持德定的膠體狀態(tài)，稱膠體金。膠體金在接近蛋白質(zhì)等電點或稍偏堿的環(huán)境下帶有負(fù)電量，能吸引抗體，從而把抗體標(biāo)記，膠體金除可以和免疫球蛋白結(jié)合外，還可以和佰萄球菌A蛋白、植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)等多種大分子結(jié)合，膠體金的這些特性有利于把膠體金用于多方面的標(biāo)記研究。
用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行示蹤染色稱免疫金染色(imraua>gukl staiming，1GS)，在檢查細(xì)胞抗原中，首先用特異性第一抗體(如單克隆抗體)與抗原結(jié)合，再與膠體金標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)(間接法)或抗原直接與膠體金標(biāo)記的第一抗體反應(yīng)(直接法)，在電鏡下可見黑色圓形的金顆粒，即為抗原所在的部位。
1.膠體金標(biāo)記技術(shù)有以下優(yōu)點:
(l)膠體金顆粒電子密度高，又為網(wǎng)形，在電鏡下易辨認(rèn)，與鉛染液、鈾染液形成的沉淀物很容易區(qū)別，有精確的定位能力。
(2)免疫膠體金染色非特異性吸附較低。
(3)制備的膠體金顆粒可以有不同的大小，因此可進(jìn)行雙重和多重標(biāo)記。
(4)由于金顆粒具有高電子密度，有較強的發(fā)射2次電子的能力，是掃描電鏡樣品的理想標(biāo)記物。
(5)膠體金本身有顏色，它還可以用銀增染，能滿意地用于光學(xué)偏光顯微鏡觀察。
(6)金顆粒有較強的折光性，可用做流式細(xì)胞儀的標(biāo)志物。
(7)膠體金側(cè)備過程比較簡單，膠體金及其與免疫球蛋白等大分子的結(jié)合不涉及化學(xué)反應(yīng)，但在側(cè)備中要求精確的試劑濃度、PH值和離子強度。
(8)膠體金技術(shù)還可以研究凝集素受體的定位。最近，有學(xué)者己把核酸雜交技術(shù)和膠體金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來，在亞細(xì)胞水平上研究各種核酸片段。
2.膠體金標(biāo)記的方法:膠體金標(biāo)記在透射電鏡上獲得廣泛的應(yīng)用，它的標(biāo)記方法有包埋前標(biāo)記和包埋后標(biāo)記。
(1)包埋前標(biāo)記:主要用于細(xì)胞表面杭原的定位和定量研究，可以用直接法和間接法，前者特異性好，后者敏感性高。膠體金標(biāo)記技術(shù)除用于單標(biāo)記以外，還可以用于雙標(biāo)記或多標(biāo)記，即用二種或多種大小不同的金頤粒結(jié)合不網(wǎng)的第一抗體(或其他生物大分子)，以標(biāo)記細(xì)胞上相應(yīng)的不同的抗原分子。
由于金顆粒較大，不能通過完整的細(xì)胞膜，若檢測細(xì)胞內(nèi)的抗原，需用皂角求或其它去污劑等處理細(xì)胞，使細(xì)兒膜的通透性加大，以使金頤拉進(jìn)人細(xì)胞。
(2)包埋后標(biāo)記:為了使膠體金與胞內(nèi)杭原充分作用，用低滋包埋的切片，冷凍切片，有時也可以用常規(guī)包埋的切片做膠體金標(biāo)記，這時被檢測抗原需能耐受高溫聚合的影響而不失去抗原活性。
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