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    前面介紹的明視野、暗視野、相差體式顯微鏡都是用發自光源的可見光對樣品進行照明和成像，因此觀察到的是標本直接的本色。而熒光顯微鏡觀察的物像是由樣品被激發后發出的熒光形成的，光源的作用僅僅是作為樣品熒光的橄發光，不進人目鏡用于物像的生成。

    某些物質可以吸收輻射能而被滋發，并在稍后以波長較長的光能形式將所吸收的大部分能量釋放出來，這種波長長于激發光的可見光就是熒光。微生物細胞和細胞內的某些物質在紫外線或藍縈光的激發下會自發地產生熒光，可直接使用熒光體式顯微鏡進行觀察。而自身不產生熒光的標本，則需經熒光染料(熒光素)染色后再進行觀察。由于不同熒光索被滋發后的熒光波長范圍會有差異，因此同一樣品在需要的時候可以用兩種以上的熒光素標記，從而在熒光體式顯微鏡下經過一定波長的光激發后顯示不同的顏色，方便對樣品特定部位或成分的定位、定量觀察和分析。

    按照激發光光源光路與觀察標本相對位置的不同，熒光體式顯微鏡可分為透射式和落射式兩種。透射式熒光顯微鏡的光源光線是通過聚光器穿過標本材料來激發熒光，因此低倍鏡時熒光強，而隨故大倍數增加其熒光減弱，所以對觀察較大的標本材料較好。此外，由于它的激發光束必須穿過載物玻片，為了減少滋發光線的損失，觀察時需使用價格昂貴的石英玻璃級玻片，也不能用于觀察非透明的被檢物體。與之相比，落射熒光體式顯微鏡的激發光路不經過毅玻片而直接照射在標本上，橄發光的損失小，熒光效應離，還能對非透明的標本進行觀察。目前透射式熒光體式顯微鏡已經越來越少，大多數熒光顯微鏡都采用落射式進行熒光滋發。

    正置落射熒光體式顯微鏡的基本光路圖。其特點是光源通過物鏡落射于樣品，激發產生的熒光再通過物鏡進人目鏡，因此放大倍數越大熒光越強，視野照明均勻，成像清晰。光路中激發漣鏡的作用是濾掉來自高壓汞燈的雜光，僅讓特定波長的激發光透過。光路中的二分色鏡由鍍膜的光學玻璃制成，兼有透射長波光線和反射短波光線的功能，其鏡面方位與激發光和熒光的光軸交角均呈45℃，可將短波長的激發光向下反射，通過物鏡投射向載玻片上的標本，激發釋放出的熒光通過物鏡，穿過二分色鏡和目鏡即可進行觀察。目鏡下方安下的阻斷濾鏡只允許特定波長的熒光通過，以保護觀察者的眼晌并降低視野亮度，由于每種熒光物質都有一個產生最強熒光的激發光波長，被激發產生的熒光也具有專一性，因此在實際使用時阻斷旅鏡應根據需要和激發濾鏡配合使用。換用不同的激發濾鏡/阻斷濾鏡的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。